介绍
人类基因组中有多达三十亿个碱基对。因此，基因组学的核心挑战和最终愿景是描述这三十亿个碱基对中的每一个对特定基因调控和下游蛋白质功能的影响。 。因此，如何系统、高通量地诱导靶基因组序列突变成为核心技术挑战。当研究人员关注单个基因组位点时，如何利用区域定点突变来模拟自然进化过程，揭示序列与表型之间的关系，该领域目前还缺乏更好的技术平台。
2024年10月11日，来自布罗德研究所（Broad）和哈佛大学丹纳法伯癌症研究中心（Dana-）的Fei Chen和E.研究团队发表了题为“for of ”的研究论文（哈佛大学博士生候选人Xi Dawn Chen和博士后研究员陈泽宇为共同第一作者），通过融合解旋酶（ ）和脱氨酶（ ）形成解旋编辑器（ ），并将解旋酶编辑器与nCas9或dCas9结合，引导至特定的基因组靶向区域我们成功地在人类细胞中实现了基因组原位长程、位置饱和的分散诱导突变，在哺乳动物细胞中建立了原位定向进化系统，并在多种人类细胞系中取得了成功。它实现了筛选耐药单碱基突变、RNA剪切酶活性位点和原位增强子功能碱基等重要的生物学过程。
研究人员首先选择PcrA M6解旋酶作为切入点，将其与能够诱导C->U突变（DNA复制后表现为C->T或反链G->A）的胞苷脱氨酶AID结合，形成AID 。 HE和针对特定基因组位点的sgRNA、nCas9(D10A)和HE被转染到细胞中并突变72小时。研究人员发现，只有当细胞同时呈现HE系统和nCas9-sgRNA系统时，目标靶区域才会发生显着突变。突变方向以单侧为主，长度可达1kb以上，平均每个碱基突变率约为0.5%。其中，反链中的G->A突变为显性突变类型。随着突变时间的增加，每条单链上的突变也会积累。因此，研究人员将该系统命名为HACE(-)系统，即解旋酶介导的连续突变系统。
接下来，研究人员建立了模块化的HACE系统，构建了不同的解旋酶（BLM、NS3h、PcrA、PcrA M6等）、不同的脱氨酶（AID、TadA、TadDE）和不同的Cas9（nCas9 D10A，nCas9的功能描述矩阵） H840A，dCas9）系统地描述了每个组合条件下的突变率、突变方向、G->A和C->T偏好，并且还实现了A->G或T->C突变使得HACE系统能够进行工具盒替换在不同的使用场景下，根据目标区域的预期突变特征，实现不同目的的单碱基筛选。
接下来，研究人员将利用HACE系统筛选癌细胞的耐药机制。研究人员将针对MEK1外显子区域的HACE系统引入A375细胞中，并使用两种MEK1抑制剂来筛选耐药点突变。经过20天的耐药性筛选，研究人员发现存活的A375细胞中富集了G128D、G202E和E203K等多个点突变。使用MAPK通路的单碱基编辑器和活性报告系统进行验证发现，这些点突变可以显着增强MAPK活性并促进细胞在药物环境中的存活和扩增。 PDB结构分析进一步发现上述突变位点均落在药物结合区周围，解释了MEK1突变的耐药机制。
此外，研究人员应用 HACE 系统来识别影响 RNA 剪切的体内酶促突变位点。研究人员将RNA剪切报告系统引入细胞中，设计了多个靶向SF3B1的sgRNA，然后将HACE系统作为一个整体引入到含有该报告系统的细胞中。亚群分选是根据报告系统中异常剪接mRNA（GFP报告基因）的强度进行，筛选出对RNA剪接有重要影响的细胞亚群，并鉴定其目标区域的基因型。研究人员利用单碱基编辑和预编辑发现并验证了多个可影响RNA剪切的SF3B1突变位点，并在PDB结构分析中证实这些突变所属的蛋白质区域是与RNA结合相关的部分。
最后，研究人员设计了多个针对CD69增强子的sgRNA，并利用HACE系统对CD69基因的增强子进行突变筛选，发现了多个重要的转录因子结合区域，如ETS/IRF、GATA、RUNX等。 ，揭示这些转录因子家族可以对 CD69 基因表达产生重要影响。进一步地，在探索RUNX结合区如何影响CD69表达的过程中，研究人员发现HACE筛选出的单碱基突变并没有强制人工连锁，而用于验证的单碱基编辑器由于存在强制人工连锁而存在强制人工连锁。突变。人为连接破坏了RUNX结合域并引入了GATA结合区，导致分子库筛选时单碱基编辑很可能无法识别这个重要的调控区域。因此，研究人员随后使用试点编辑来改进 HACE 筛查位点的系统验证。
模式图(:)
综上所述，HACE是一种连续突变子，具有可编程、多靶点、能够连续突变、低频、定向、目标区域内随机、位置饱和、罕见强制连锁等特点，可实现哺乳动物基因组的定向进化。原地。
参考
