刘墨芳研究员，中国科学院分子与细胞科学卓越创新中心
2006年，刘墨芳结束在美国约翰·霍普金斯大学医学院的研究生涯，回到中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所王恩铎研究组，担任副组长。刘墨芳从事RNA研究多年。此时此刻，她非常渴望独自在RNA领域开辟一片新天地。
正是在这一年，RNA领域出现了重要的新突破。
包括中国科学家林海帆在内的多个研究小组在小鼠和果蝇等多种模式生物的生殖细胞中发现了一类新的小RNA分子。由于这种新型小RNA分子与果蝇生殖细胞中的Piwi蛋白一起发挥作用，研究人员将其命名为Piwi相互作用RNA（Piwi RNA），简称piRNA。
piRNA可以算是生物体中非常“低调”的一类分子：首先，piRNA集中在生殖细胞中，在大多数其他体细胞中基本不表达；其次，即使在生殖细胞中，piRNA也不会进一步合成蛋白质分子，而只是以RNA分子的形式默默存在。
但与此同时，piRNA 具有高度多样性。以小鼠生殖细胞为例，已发现超过一百万种不同序列的piRNA。
那么问题就变成了，为什么生殖细胞中表达如此广泛的 piRNA？ piRNA到底有哪些生物学功能？
最初的几项研究发现，许多piRNA序列可以与一种称为转座子的DNA元件相匹配，从而抑制这些转座子序列的表达。
转座子是一大类可以在基因组中不同序列之间“跳跃”的分子。转座子的跳跃有一定概率引起基因突变，因此从长远来看是生物进化的重要驱动力之一。但对于生物个体来说，过度活跃的转座子并不是一件好事。由此产生的基因突变将增加患癌症等疾病的风险。因此，人们此前就发现细胞已经进化到可以特异性控制转座子活性低于一定的频率。分子机制。
具体到生殖细胞，比如精子细胞，因为它们肩负着将遗传信息完整、准确地传递给下一代的重要使命，研究人员推测，这里对转座子活性的“控制”会比其他细胞更好。类型更加严格。
piRNA的出现完美证实了这一推测：piRNA就像是专门为生殖细胞添加的一道“安全门”，确保生殖细胞中转座子的活性被抑制在较低水平。 。
但刘墨芳注意到，并不是所有的piRNA分子都能匹配转座子序列。
那么这些无法匹配转座子序列的“特殊”piRNA分子是否仍然具有未知的生物学功能呢？
此外，科学家在实验室对小鼠、果蝇等模型动物进行基因敲除操作，破坏piRNA的产生或功能，从而导致模型动物无法繁殖。
那么，如果我们人类的 piRNA 生产或功能失败，会产生什么后果呢？
刘墨芳决定将这些问题作为其团队的主要研究方向。
转座子以外的目标
2010年，法国研究小组发现，piRNA参与果蝇胚胎发育过程中编码发育因子Nanos的信使RNA的降解。 piRNA结合蛋白Aub的破坏将导致Nanos信使RNA的清除延迟，进而导致胚胎头部生长。出现发育缺陷。
这一发现首次表明，除了转座子序列之外，能够编码蛋白质的信使RNA也可以被piRNA靶向和调控。
在果蝇中发现的这一病例，进一步坚定了刘墨芳在哺乳动物中系统寻找piRNA新靶点和新功能的信心。
piRNA在小鼠精子形成过程中的一个有趣而特殊的性质，为刘墨芳提供了突破：原来，在精子细胞最终形成蝌蚪状成熟精子的过程中，出现了两波piRNA表达峰，且没有转座子。已匹配。 piRNA序列主要存在于第二波表达峰。
因此，刘墨芳团队首先从小鼠睾丸组织中分离出第二波piRNA表达高峰的精子细胞，然后纯化含有piRNA的复合物。经过深度测序，他们惊喜地发现，虽然分离的复合物中与piRNA配对的RNA分子中有超过2/3是与转座子序列匹配的“经典”piRNA，但大约20%仍然存在。编码蛋白质的信使RNA。
接下来，他们选择了十对相互匹配的piRNA和信使RNA，验证了它们之间的物理相互作用，并通过功能研究证明特定piRNA的存在会促进相应信使RNA的降解。
如何理解这一发现的意义？
结果表明，piRNA促进的信使RNA降解主要发生在精子细胞从圆形向长杆状转变的过渡阶段。对于最终成熟的精子，为了保证足够的活动力，应尽可能去除可能增加负荷的物质。例如，就像神舟飞船一样，在发射过程中，超重的助推器会一一脱落，只剩下一个载着宇航员进入太空的“大铁球”。在精子形成的过程中，细胞首先从最初的圆形变成长杆状，最后变成蝌蚪状。细胞中的大部分信使RNA需要被清除。
刘墨芳团队的工作表明，piRNA在帮助精子细胞减轻负荷方面发挥着关键作用。
也就是说，在精子形成的特定阶段，piRNA还扮演着“清洁工”的光荣使命。
能做更多工作的piRNA：除了清洗之外，它还负责部分生产工作
刘沫芳团队选取了100多对piRNA和信使RNA进行验证。大多数piRNA会促进信使RNA的降解，从而导致编码蛋白质水平的降低。
但有 5 对例外：研究人员惊讶地发现这些 piRNA 的表达并没有影响相应信使 RNA 的含量；而对于编码的蛋白质来说，piRNA的表达不但没有引起蛋白质水平的下降，反而引起了蛋白质水平的下降。水平上升了！
这种离奇的现象究竟是由于实验操作的失误，还是背后隐藏着未知的新生物学原理？
刘墨芳团队并没有轻易放过这五对意想不到的“异常现象”。通过对他们的深入探索，他们终于有幸回答了精子发育领域的另一个重要问题。
“转录-翻译解偶联”现象是长期以来困扰精子发生领域研究人员的一个谜团：精子细胞在发育过程中，为了“瘦身”，首先必须压缩携带基因组信息的细胞核，但这操作 终止细胞核内信使 RNA 的转录；为了保证精子发育所需蛋白质的产生，精子细胞会提前合成所需的信使RNA，并将其储存在一种名为“信使核糖核蛋白”（简称mRNP）的蛋白质复合物中。 mRNP就像细胞搭建的临时“仓库”。 mRNP 中储存的信使 RNA 处于“休眠”状态，翻译蛋白质的活性非常低。
当精子发育进展，形状由圆形变为长杆状时，mRNP中储存的信使RNA会有序释放，然后快速翻译产生精子发育后期所需的蛋白质。
在精子形成过程中，这种先转录合成信使RNA，然后并不立即翻译蛋白质，而是先将其储存在mRNP复合物中，然后在适当的时候恢复翻译活动的机制，被称为“转录-翻译解偶联”现象。
刘默芳团队注意到，在5种能够意外提高蛋白质水平的piRNA中，恰好有两种编码对精子发育后期非常重要的蛋白质。
由此，他们推测piRNA是否是促进mRNA释放信使RNA并重新激活蛋白质翻译的关键分子？
事实正如他们所料：特定的piRNA可以通过与信使RNA末端的特殊序列结合，招募一系列翻译调控因子来激活信使RNA的翻译。
而且，他们还发现这种新机制并不局限于之前发现的5种piRNA。进一步的蛋白质组学实验结果表明，这种依赖piRNA途径的翻译激活机制可以扩展到数百种以上的不同蛋白质。
这一发现进一步确立了piRNA在生殖细胞中“劳模”的地位：首先，它们可以在精子发育的整个过程中抑制转座子活性，以保证基因组的稳定性；其次，它们还可以重新激活mRNP中存储的信使RNA的翻译活性；最后保证精子发育后期信使RNA的清除，使最终成熟的精子能够轻盈行走，具有较强的运动能力。
综上所述，刘沫芳团队的这一系列研究工作发现，piRNA对精子细胞中的信使RNA具有双重调控作用。
激活翻译的好帮手：具有相分离能力的FXR1
随着piRNA在“转录-翻译解偶联”现象中的功能被阐明，刘墨芳团队对精子发育不同阶段mRNP复合物的动态变化产生了浓厚的兴趣。
但精子细胞如何知道何时重新激活蛋白质翻译呢？
为了回答这个问题，刘墨芳团队从幼年和成年小鼠睾丸中纯化出高活性核糖体复合物，并利用蛋白质组学方法鉴定出成年小鼠睾丸中富集的12个翻译调控因子。 。其中，一种名为FXR1的蛋白质引起了研究人员的特别兴趣。
随着精子细胞形状的变化，FXR1蛋白的表达也逐渐增加。此外，FXR1可以与数千个不同序列的信使RNA分子结合并促进相应蛋白质的翻译。更有趣的是，FXR1的同源蛋白具有特殊的“相分离”特性——随着其浓度的增加，它可以形成一种特殊类型的结构，在细胞中聚集在一起。
那么FXR1是否也具有类似的相分离特性呢？
体外实验表明，随着浓度的增加，FXR1确实可以形成相分离特有的结构。同时，敲除生殖细胞中的 FXR1 会导致雄性小鼠出现不育表型。
由此，刘墨芳团队做出了大胆猜想：在精子发育过程中，FXR1蛋白水平的增加可能通过相分离机制将分散的mRNP复合物聚集在一起，从而释放mRNP复合物对翻译的抑制。活动推动精子发育到下一阶段。
为了验证这个猜想，他们设计了一个精彩的实验：通过突变筛选，研究人员鉴定出了FXR1突变体。与原始FXR1相比，该突变体仅在关键位置的一个氨基酸有所不同。它结合RNA分子的能力保持不变，但失去了相分离的能力。当小鼠精子细胞中的FXR1蛋白被突变版本取代时，研究人员惊讶地发现mRNP复合物的翻译激活能力显着降低。
看来FXR1蛋白确实有可能通过相分离机制调节精子细胞中的翻译激活。
这一发现开创了相分离在精子发育中的重要作用。刘墨芳团队于2021年5月25日将论文提交给《科学》杂志。
但正是由于这一发现的重要性，审稿人对论证的细节提出了许多谨慎的问题。有趣的是，其中一位审稿人在审稿意见中写道：“即使相分离模型将来被证明是错误的，这项工作的发现也是新颖且重要的。研究人员做了很多工作，如果是我的评论推迟了这部作品的出版，我深表歉意……”
经过十个月的精心修改，刘墨芳团队于2022年3月23日将这篇带有更多补充实验的论文重新提交给进行审稿，最终于2022年8月12日正式发表。
充分利用胜利
2006年至今，刘墨芳团队一直在piRNA领域深耕细作，不断加深人们对精子细胞发育调控机制的认识。
同时，他们也关心基础研究能给临床带来的帮助。 《Cell》发表的作品之一是，研究团队与上海市计划生育研究所合作，对413名临床无精子症和弱精子症患者进行了筛查，发现3名患者存在Piwi基因突变。研究人员利用敲入突变小鼠模型证明了患者携带的Piwi基因突变是不孕不育的罪魁祸首，揭示了此类突变的致病机制，并根据致病机制设计了干预策略，可以在一定程度上恢复突变小鼠的精子活力为男性不育患者的治疗提供了潜在的策略。这项工作首次证明piRNA途径突变是男性不育的新原因。
继这一开创性研究之后，刘墨芳团队乘胜追击，与湘雅生殖医学中心合作，通过人类遗传学方法，筛选出与男性不育患者相关的piRNA通路中新的基因突变。研究发现，除了Piwi基因外，piRNA途径其他成分的突变也会导致精子发育异常。 piRNA加工酶是典型代表。国际同事此前曾使用小鼠模型来证明异常会导致男性不育。 2021年，他们还采用了与刘墨芳相似的人类遗传学思想，发现了导致不孕患者功能丧失的多种突变。
刘墨芳团队的研究结果与他们同事的研究结果相呼应，他们还鉴定出了患者蛋白质活性位点的突变，进一步丰富了人们对piRNA通路与精子发育之间联系的理解。
最近，他们在男性不育症患者中发现了一种新的Piwi基因突变。这种突变导致piRNA变短，导致piRNA减慢，无法激活翻译并产生精子发育所需的蛋白质，从而影响精子发育。男性生育能力。
这些工作为今后不孕症患者的筛查和治疗提供了坚实的理论基础。
piRNA通路，精子发育的低调守护者，其背后隐藏着多少未知的惊喜？
让我们拭目以待。
（作者黄宇翔是密歇根大学博士生，主要研究“自噬的调控机制”，科普作品主要集中在生命科学及相关学科）
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